Меню

ГОСТ 25179 2014 МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА

Таблица массовой доли белка

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Методы определения массовой доли белка

Milk and milk products. Method for determination of protein

Дата введения 2015-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИМИ» Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июля 2014 г. N 68-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по
МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 25 сентября 2014 г. N 1221-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 25179-2014 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

6 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Ноябрь 2019 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты (молочное сырье, питьевое молоко, сухое молоко) и устанавливает методы определения массовой доли белка: формольного титрования и колориметрический.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4172 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4204 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 11773 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный. Технические условия

ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 26809 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

В Российской Федерации действует ГОСТ Р 55063-2012 «Сыры и сыры плавленые. Правила приемки, отбор проб и методы контроля», ГОСТ Р 55361-2012 «Жир молочный, масло и паста масляная из коровьего молока. Правила приемки, отбор проб и методы контроля».

ГОСТ 27752 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29251 (ИСО 385-1-84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 34454 Продукция молочная. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Отбор проб

3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу — по ГОСТ 26809.

3.2 Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4±2)°С не более суток.

4 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории следует соблюдать следующие условия:

Источник

ГОСТ 25179-2014 МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА

Добавил: Богдан Кривошея

Дата: [31.05.2016]

ГОСТ 25179-2014 МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА

Milk and milk products. Method for determination of protein

Дата введения — 1 июля 2015 г.

Взамен ГОСТ 25179-90

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты (молочное сырье, питьевое молоко, сухое молоко) и устанавливает методы определения массовой доли белка: формольного титрования и колориметрический.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты*

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ISO 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике**

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 11773-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 23327-98 Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка.

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные. Настенные и часы будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний.

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29251-91 (ИСО 385-1-84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом, следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Отбор проб

3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу — по ГОСТ 26809.

3.2 Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4±2)°С не более суток.

4 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории следует соблюдать следующие условия:

температура окружающего воздуха . (20±5°С;

относительная влажность воздуха . (55±25) %;

атмосферное давление . (95±10) кПа.

5 Метод формольного титрования

Метод распространяется на непастеризованное молоко с титруемой кислотностью не выше 20°Т.

Метод применяют при условии согласования с поставщиком.

5.1 Сущность метода

Метод основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Анализатор потенциометрический (или рН-метр) с диапазоном измерения от 1 до 14 ед. рН и допускаемой абсолютной погрешностью ±0, 05 ед. рН.

Магнитная мешалка с частотой вращения 800 об/мин.

Секундомер механический типа СОПир 3-го класса.

Колбы 1-1000-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-2-5, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Воронки В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы В-1-50, В-2-50 по ГОСТ 25336.

Бюретки 1-1(2)-1-25-0, 05, 1-1(2)-2-25-0, 05 по ГОСТ 29251.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч. или стандарт-титр, раствор молярной концентрации с (NaOH) = 0, 1 моль/дм 3 .

Формальдегид, водный раствор с массовой долей формальдегида 36, 5% — 37, 5%, по нормативным и техническим документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.3 Подготовка к проведению измерений

5.3.1 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) = 0, 1 моль/дм 3

Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0, 1 моль/дм 3 и проверку его молярной концентрации проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 25794.1.

Раствор хранят не более 1 мес при температуре (20±5)°С в бутыли из темного стекла.

5.3.2 Определение поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования

Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формольного титрования и методом Кьельдаля (ГОСТ 23327).

Измерения проводят в средней пробе молока, полученной смешиванием равных по массе образцов молока, полученных от разных хозяйств. При этом средняя проба должна быть образована не менее чем от 75% всех хозяйств-сдатчиков молока.

Измерения как по ГОСТ 23327, так и методом формольного титрования проводят в шести повторностях, определяют среднеарифметические значения.

Поправку К, %, вычисляют по формуле

где X1 — среднеарифметическое значение шести измерений массовой доли белка, полученное по ГОСТ 23327, %;

X2 — среднеарифметическое значение шести измерений массовой доли белка, полученное формольным титрованием, %.

Определение поправки проводят не реже одного раза в десять дней.

5.4 Проведение измерений

5.4.1 В стакан помещают 20 см 3 молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Постепенно добавляют раствор гидроокиси натрия. При достижении точки эквивалентности (рН = 9) и истечении времени выдержки (30 с) после достижения точки эквивалентности определяют количество раствора гидроокиси натрия, пошедшее на нейтрализацию молока до внесения формальдегида. Затем вносят в стакан 5 см 3 формальдегида.

По истечении 2, 0 — 2, 5 мин продолжают титрование. По окончании процесса определяют общее количество раствора, затраченного на нейтрализацию.

5.4.2 Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси, состоящей из 20 см 3 дистиллированной воды и 5 см 3 раствора формальдегида.

5.5 Обработка результатов

5.5.1 Массовую долю белка X3, %, вычисляют по формуле

где V2 — общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, см 3 ;

V1 — количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида, см 3 ;

V — количество раствора, израсходованное на контрольный опыт, см 3 ;

0, 96 — эмпирический коэффициент, %/см 3 ;

К — поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

Читайте также:  Границы сердца при перкуссии норма причины расширения смещения

5.5.2 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода формольного титрования определения массовой доли белка при Р = 0, 95 приведены в таблице 1.

Диапазон измерений массовой доли белка, %

Предел повторяемости r, %

Предел воспроизводимости R, %

Границы абсолютной погрешности ±∆, %

6 Колориметрический метод

6.1 Сущность метода

Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0, 001 г.

Колориметр или спектрофотометр лабораторный со спектральным диапазоном длин волн 315 — 990 нм, диапазоном измерения коэффициента пропускания от 0, 1% до 100%, диапазоном измерения оптической плотности от 0 до 3, с кюветами длиной оптического пути 10 мм.

Анализатор потенциометрический диапазоном измерения от 1 до 14 ед. рН, погрешностью ±0, 05 ед. рН.

Термометр ртутный стеклянный с диапазоном измерения от 0°С до 100°С, с ценой деления 0, 5°С или 1, 0°С, с пределом допустимой погрешности ±1°С по ГОСТ 28498.

Центрифуга с частотой вращения не менее 1000 об/мин.

Мешалка магнитная с частотой вращения 800 об/мин.

Баня водяная термостатируемая, обеспечивающая поддержание температуры в интервале от 0°С до 100°С с погрешностью ±2°С.

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Пробки резиновые конусные N 16 или N 19 по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Штатив для пробирок.

Фильтры бумажные обеззоленные или бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Пробирки П2Т-25, П2Т-50, П3-25, П3-50 ХС по ГОСТ 25336.

Воронки В-36-50, В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы 1-50-2, 1-1000-2, 1-2000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-2-1, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Цилиндр 3-250-2 по ГОСТ 1770.

Колбы Кн-1-500-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Краситель «Амидо черный 10 Б», ч.д.а., по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Кислота лимонная по ГОСТ 3652, х.ч. или ч.д.а.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12-водный по ГОСТ 4172, х.ч. или ч.д.а. или натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 11773, х.ч. или ч.д.а.

Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч. или ч.д.а.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч.д.а., раствор массовой доли 40%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

6.3 Определение массовой доли белка в сыром и питьевом молоке

6.3.1 Подготовка к проведению измерений

6.3.1.1 Приготовление буферного раствора

В коническую колбу вместимостью 500 см 3 помещают (31, 70±0, 01) г лимонной кислоты и (8, 40±0, 01) г натрия фосфорнокислого, добавляют 400 см 3 дистиллированной воды. Содержимое колбы нагревают до температуры (68±2)°С, аккуратно перемешивая до полного растворения веществ, и затем охлаждают до температуры (20±2)°С.

6.3.1.2 Приготовление раствора красителя

В коническую колбу вместимостью 500 см 3 помещают (4, 60±0, 01) г красителя Амидо черного, добавляют 200 см 3 дистиллированной воды. Содержимое колбы нагревают до температуры (68±2)°С, аккуратно перемешивая до растворения красителя.

Затем раствор фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 2000 см 3 . Фильтр промывают дистиллированной водой до удаления следов красителя. В эту же колбу переносят буферный раствор, приготовленный по 6.3.1.1.

Содержимое колбы охлаждают до температуры (20±2)°С, доливают дистиллированной водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое путем переворачивания колбы не менее шести раз.

Измеряют значение рН полученного раствора: оно должно быть (2, 3±0, 1) ед. рН. Если рН раствора не соответствует данному значению, добавляют концентрированную серную кислоту или раствор с массовой долей гидроокиси натрия 40%.

Раствор, разбавленный в 50 раз, должен иметь оптическую плотность (0, 82±0, 02) на длине волны 590 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм. Если оптическая плотность раствора не соответствует данному значению, то исправляют ее добавлением буферного раствора или раствора красителя.

Раствор используют после 12 ч выдержки.

Срок хранения раствора в плотно укупоренной темной посуде в холодильнике при температуре (4±2)°С — не более 4 мес.

При этом значения рН и оптической плотности еженедельно проверяют и при необходимости исправляют.

6.3.2 Проведение измерений

6.3.2.1 В стеклянную пробирку пипеткой отмеряют 1 см 3 молока, добавляют 20 см 3 раствора красителя (6.3.1.2) и, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз. Следует избегать встряхивания, т.к. при этом образуется трудноразрушимая пена.

6.3.2.2 Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1500 об/мин или 20 мин при частоте вращения 1000 об/мин.

6.3.2.3 Отбирают пипеткой 1 см 3 надосадочной жидкости, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 , доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают.

6.3.2.4 В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 1 см 3 раствора красителя (6.3.1.2), объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

6.3.2.5 Измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя (6.3.2.4) по отношению к анализируемой пробе (6.3.2.4). После каждых 24 измерений кювету промывают буферным раствором, приготовленным по 6.3.1.1.

6.3.3 Обработка результатов

Массовую долю белка X4, %, вычисляют по формуле

где 7, 78 — эмпирический коэффициент, %/ед. оптической плотности;

D — измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности;

1, 34 — эмпирический коэффициент, %.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

6.3.4 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих колориметрического метода определения массовой доли белка при Р = 0, 95 приведены в таблице 2.

Диапазон измерений массовой доли белка, %

Предел повторяемости r, %

Предел воспроизводимости R, %

Границы абсолютной погрешности ±∆, %

6.4. Определение массовой доли белка в сухом молоке

6.4.1 Подготовка к проведению измерений

6.4.1.1 Приготовление раствора красителя

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают (1, 664±0, 001) г фосфорнокислого двузамещенного натрия и (1, 50±0, 01) г лимонной кислоты, добавляют 400 см 3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают. После растворения добавляют (0, 80±0, 01) г красителя Амидо черного и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое путем переворачивания колбы не менее шести раз.

Измеряют значение рН полученного раствора: оно должно быть (2, 40±0, 05) единиц ед. рН. Если рН раствора не соответствует данному значению, добавляют концентрированную серную кислоту или раствор с массовой долей гидроокиси натрия 40%.

Раствор хранят не более 7 сут. при температуре (6±2)°С в плотно укупоренной бутыли из темного стекла.

6.4.2 Проведение измерений

6.4.2.1 В центрифужную или химическую пробирку помещают 0, 17 — 0, 20 г хорошо перемешанного сухого молока, постепенно добавляют 30 см 3 раствора красителя Амидо черного (6.4.1.1) и аккуратно перемешивают в течение (5, 0±0, 5) мин при помощи магнитной мешалки с подогревом [температура раствора (28±2)°С] или (10, 0±0, 5) мин без подогрева. Допускается ручное перемешивание.

6.4.2.2 После перемешивания полученный раствор центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1500 об/мин или 20 мин при частоте вращения 1000 об/мин. Осадок отделяют фильтрованием.

6.4.2.3 Определяют оптическую плотность фильтрата при длине волны 450 — 500 нм.

6.4.3 Обработка результатов

Массовую долю белка в пробе сухого молока определяют, пользуясь градуировочным графиком.

6.4.3.1 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика готовят градуировочные образцы массовой доли белка в количестве не менее 10 шт. Значения массовой доли белка в градуировочных образцах должны находиться в интервале от 20% до 40%.

В приготовленных градуировочных образцах определяют массовую долю белка методом Къельдаля, а также оптическую плотность фильтрата, полученного по 6.4.2.

По полученным результатам строят градуировочный график. Для этого на оси абсцисс откладывают значения массовой доли белка в пробе продукта в процентах, определенные методом Кьельдаля, а на оси ординат откладывают соответствующие им значения оптической плотности. Полученные точки соединяют.

6.4.3.2 Определение массовой доли белка

По измеренному значению оптической плотности фильтрата исследуемой пробы сухого молока (6.4.2.3) с помощью градуировочного находят значение массовой доли белка.

За окончательный результат измерений массовой доли белка в сухом молоке принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

6.4.4 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих колориметрического метода определения массовой доли белка в сухом молоке при Р = 0, 95 приведены в таблице 3.

Источник



ГОСТ 25179-2014 Молоко и молочные продукты. Методы определения массовой доли белка

Текст ГОСТ 25179-2014 Молоко и молочные продукты. Методы определения массовой доли белка

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ Методы определения массовой доли белка

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научноисследовательским институтом мопочной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июля 2014 г. № 68-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по MX (ИСО 3166) 004 — 97

Код страны по МК Стандарт мформ. 2015

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства ло техническому регулированию и метрологии

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ Методы определения массовой доли белка Milk and milk products. Method for determination of protein

Дата еведеиия — 2015—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты (молочное сырье, питьевое молоко, сухое молоко) и устанавливает методы определения массовой доли белка: фор мольного титрования и колориметрический.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83. ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ISO 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 11773-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 23327-98 Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка.

ГОСТ 25336-62 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотноосновного титрования

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные. Настенные и часы будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний.

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29251-91 (ИСО 385-1-84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом, следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту осыпку.

3 Отбор проб

3.1 Отбор проб и подготовка их к анапизу — по ГОСТ 26809.

Читайте также:  Устройство технологический процесс и настройка разбрасывателя минеральных удобрений ZA M 900

3.2 Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С не бопее суток.

4 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории следует соблюдать следующие условия:

температура окружающего воздуха . (20 ± 5) °С;

относительная влажность воздуха . (55 ± 25) %;

атмосферное давление. (95 ± 10) кПа.

5 Метод формольнсго титрования

Метод распространяется на непастеризованное молоко с титруемой кислотностью не выше 20 °Т.

Метод применяют при условии согласования с поставщиком.

5.1 Сущность метода

Метод основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

5.2 Средства измерений» вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Анализатор потенциометрический (или pH-метр) с диапазоном измерения от 1 до 14 ед. pH и

допускаемой абсолютной погрешностью ± 0.05 ед. pH.

Магнитная мешалка с частотой вращения 800 об/мин.

Секундомер механический типа СОПир 3-го класса.

Колбы 1-1000-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-2-5. 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Воронки В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы В-1-50, В-2-50 по ГОСТ 25336.

Бюретки 1-1 (2>-1-25-0,05.1-1(2)-2-25-0.05 по ГОСТ 29251.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4326. х.ч. или стандарт-титр, раствор молярной концентрации с (NaOH) — 0.1 моль/дм 3 .

Формальдегид, водный раствор с массовой долей формальдегида 36,5 % — 37,5 %, по нормативным и техническим документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Веща дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерения, вспомогатепьного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метропогическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.3 Подготовка к проведению измерений

5.3.1 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) * 0,1 моль/дм 1

Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0.1 моль/дм 3 и

проверку его молярной концентрации проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 25794.1.

Раствор хранят не более 1 мес при температуре (20 ± 5) в С в бутыли из темного стекла.

5.3.2 Определение поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования

Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формольного титрования и методом Кьельдаля (ГОСТ 23327).

Измерения проводят в средней пробе молока, полученной смешиванием равных по массе образцов молока, полученных от разных хозяйств. При этом средняя проба должна быть образована не менее чем от 75 % всех хозяйств сдатчиков молока.

Измерения как по ГОСТ 23327. так и методом формольного титрования проводят в шести повторностях, определяют среднеарифметические значения.

Поправку К. %. вычисляют по формуле

где Xi — среднеарифметическое значение шести измерений массовой допи белка, полученное по ГОСТ 23327, %:

Х2 — среднеарифметическое значение шести измерений массовой доли белка, полученное формольным титрованием. %.

Определение поправки проводят не реже одного раза в десять дней.

5.4 Проведение измерений

5.4.1 В стакан помещают 20 см* молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Постепенно добавляют раствор гидроокиси натрия. При достижении точки эквивалентности (рН=9) и истечении времени выдержки (30 с) после достижения точки эквивалентности определяют количество раствора гидроокиси натрия, пошедшее на нейтрализацию молока до внесения формальдегида. Затем вносят в стакан 5 см 3 формальдегида.

По истечении 2.0 — 2,5 мин продолжают титрование. По окончании процесса определяют общее количество раствора, затраченного на нейтрализацию.

5.4.2 Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси, состоящей из 20 см* дистиллированной воды и 5 см ь раствора формальдегида.

5.5 Обработка результатов

5.5.1 Массовую долю белка X*. %. вычисляют по формуле

где V2— общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, см 3 :

V, — количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида.

Vo — количество раствора, израсходованное на контрольный опыт, см 3 :

0.96 — эмпирический коэффициент, %/см 3 :

X- поправка к результату измерения массовой доли белка. %.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

5.5.2 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода формольного титрования определения массовой доли белка при Р — 0.95 приведены в таблице 1.

массовой доли белка.

6 Колориметрический метод

6.1 Сущность метода

Метод основан на способности белков молока при pH ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора.

6.2 Средства измерений» вспомогательное оборудование» посуда и реактивы

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ± 0,001 г.

Колориметр или спектрофотометр лабораторный со спектральным диапазоном длин волн 315 -990 нм, диапазоном измерения коэффициента пропускания от 0.1 % до 100 %, диапазоном измерения оптической плотности от 0 до 3. с кюветами длиной оптического пути 10 мм.

Анализатор потенциометрический диапазоном измерения от 1 до 14 ед. pH. погрешностью ± 0,05 ед. pH.

Термометр ртутный стеклянный с диапазоном измерения от 0 *С до 100 *С. с ценой деления 0.5 в С или 1.0 в С. с пределом допустимой погрешности ± 1 в С по ГОСТ 28498.

Центрифуга с частотой вращения не менее 1000 об/мин.

Мешалка магнитная с частотой вращения 800 об/мин.

Баня водяная термостатируемая, обеспечивающая поддержание температуры в интервале от 0 °С до 100 °С с погрешностью ± 2 °С.

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Пробки резиновые конусные No 16 или No 19 по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Штатив для пробирок.

Фильтры бумажные обеззопенные или бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Пробирки П2Т-25. П2Т-50. ПЗ-25, ПЗ-50 ХС по ГОСТ 25336.

Воронки В-36-50. В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы 1-50-2. 1-1000-2.1-2000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-2-1. 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Цилиндр 3-250-2 по ГОСТ 1770.

Колбы Ки-1-500-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Краситель «Амидо черный 10 Б», чщ.а., по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Кислота лимонная по ГОСТ 3652, х.ч. или чщ.а.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный. 12-водный по ГОСТ 4172. х.ч. или ч.д.а. или натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 11773. х.ч. или ч.д.а.

Кислота серная по ГОСТ 4204. х.ч. или ч.д.а.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. ч.д.а.. раствор массовой доли 40 %.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.

6.3 Определение массоной доли белка в сыром и питьевом молоке

6.3.1 Подготовка к проведению измерений

6.3.1.1 Приготовление буферного раствора

В коническую колбу вместимостью 500 см 3 помещают (31,70 ± 0.01) г лимонной кислоты и (8.40 ± 0.01) г натрия фосфорнокислого, добавляют 400 см 3 дистиллированной воды. Содержимое колбы нагревают до температуры (68 ± 2) °С. аккуратно перемешивая до полного растворения веществ, и затем охлаждают до температуры (20 ± 2) °С.

6.3.1.2 Приготовление раствора красителя

В коническую колбу вместимостью 500 см 3 помещают (4,60 ± 0,01) г красителя Амидо черного, добавляют 200 см 3 дистиллированной воды. Содержимое колбы нагревают до температуры (68 ± 2) °С. аккуратно перемешивая до растворения красителя.

Затем раствор фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 2000 см 3 . Фильтр промывают дистиллированной водой до удаления следов красителя. 8 эту же колбу переносят буферный раствор, приготовленный по 6.3.1.1.

Содержимое колбы охлаждают до температуры (20 ± 2) °С. доливают дистиллированной водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое путем переворачивания колбы не менее шести раз.

Измеряют значение pH полученного раствора: оно должно быть (2.3 ± 0.1) ед. pH. Если pH раствора не соответствует данному значению, добавляют концентрированную серную кислоту или раствор с массовой долей гидроокиси натрия 40 %.

Раствор, разбавленный в 50 раз. должен иметь оптическую плотность (0.82 ± 0.02) на длине волны 590 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм. Если оптическая плотность раствора не соответствует данному значению, то исправляют ее добавлением буферного раствора или раствора красителя.

Раствор используют после 12 ч выдержки.

Срок хранения раствора в плотно укупоренной темной посуде в холодильнике при температуре (4 ± 2) С С — не более 4 мес.

При этом значения pH и оптической плотности еженедельно проверяют и при необходимости исправляют.

6.3.2 Проведение измерений

6.3.2.1 В стеклянную пробирку пипеткой отмеряют 1 см 1 молока, добавляют 20 см 3 раствора красителя (6.3.1.2) и. закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз. Следует избегать встряхивания, т.к. при этом образуется груднораэрушимая пена.

6.3.2.2 Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1500 об/мин или 20 мин при частоте вращения 1000 об/мин.

6.3.2.3 Отбирают пипеткой 1 см 3 надосадочной жидкости, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 , доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают.

6.3.2.4 В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 1 см 3 раствора красителя (6.3.1.2). объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

6.3.2.5 Измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя (6.3.2.4) по отношению к анализируемой пробе (6.3.2.4). После каждых 24 измерений кювету промывают буферным раствором, приготовленным по 6.3.1.1.

6.3.3 Обработка результатов

Массовую долю белка Хв. %. вычисляют по формуле

где 7.78 — эмпирический коэффициент, %/ед. оптической плотности:

О — измеренная оптическая плотность, ад. оптической плотности.

1.34 — эмпирический коэффициент. %.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях повторяемости, округленное до второго десятичного знака, если выполняется условие приемлемости по разделу 7.

6.3.4 Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих колориметрического метода определения массовой доли белка при Р = 0.95 приведены в таблице 2.

Источник

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА МЕТОДОМ

КЬЕЛЬДАЛЯ

Метод основан на минерализации навески продукта при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии катализато­ров. При этом углерод и водород органических соединений окис­ляются до диоксида углерода и воды, азот, освобождаемый в ви­де аммиака, соединяется в колбе с серной кислотой, образуя сульфат аммония. Схематично происходящие реакции могут быть представлены следующим образом:

На последующей стадии дистилляции раствор сульфата ам­мония обрабатывают концентрированным раствором гидроксила натрия, при этом аммиак освобождается и улавливается титро­ванным раствором серной кислоты. Избыток серной кислоты оттитровывают раствором гидроксида натрия. Метод Кьельдаля применяют в нескольких модификациях, отличающихся в основ­ном условиями минерализации. Для ускорения процесса вводят различные катализаторы: оксид меди, селен, свинец и другие, повышают температуру кипения серной кислоты добавлением со­лей, сульфата калия или натрия, сочетают добавление катализа­тора и солей при сжигании навески.

Методом Кьельдаля в любой модификации определяется ко­личество общего азота. Массовая доля белка вычисляется умно­жением полученной величины общего азота на переводной коэф­фициент 6,25, исходя из того, что в белках в среднем содержится 16% азота. Условность полученных результатов при таком пере­счете очевидна, так как не весь азот пищевого продукта находит­ся в форме белка и, кроме того, процентное содержание азота в белках подвержено колебаниям как в сторону повышения, так и в сторону понижения от 16%. В некоторых продуктах азотистые вещества небелкового характера достигают значительных коли­честв (мышечная ткань рыбы—15%, мясо животных—10— 16% от общего количества азотистых веществ).

Следовательно, для получения более точных результатов не­обходимо либо при пересчете общего азота на белок использо­вать различные коэффициенты в зависимости от процентного со­держания азота в белках отдельных продуктов: мясо и овощи — 6,25; пшеница, рожь, горох и др. — 5,7; гречиха, рис — 6,0; моло­ко — 6,37 и т. д., либо белковый азот определять отдельно специ­альными методами.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ

МЕТОДОМ

Спе­цифической реакцией на содержание белка является биуретовая реакция, так как ее дают полипептидные связи. Она получила свое название от производного мочевины — биурета, который об­разует в щелочном растворе медного купороса окрашенное комп­лексное соединение. Интенсивность окрашивания пропорциональ­на содержанию пептидных связей, а, следовательно, и концент­рации белка в растворе.

Биуретовую реакцию дают все белки, пептоны и полипепти­ды, начиная с тетрапептидов.

Эта реакция длительное время использовалась как качественная реакция на белок. В дальнейшем она стала применяться для количественного определения белка в различных объектах. Биуретовый метод применяют в различных модификациях, раз­личающихся условиями экстрагирования белка, способами вне­сения биуретового реактива и техникой колориметрирования.

Ниже приводится биуретовый метод определения массовой доли белка в муке в модификации Дженнингса, экспериментальная проверка которого выяви­ла ряд его преимуществ перед другими модификациями.

Читайте также:  Слияние электронных таблиц с Python Append

Биуретовый реактив— 15 см 3 10 н. раствора КОН и 25 г сегнетовой соли, взятой с погрешностью ±0,01 г, растворяют примерно в 900 см 3 дистиллирован­ной воды в мерной колбе вме­стимостью 1000 см 3 . Медленно добавляют при постоянном перемешивании 30 см 3 4 %-ного раствора CuSO4, отмерен­ных цилиндром, и доводят объем колбы до метки дистил­лированной водой.

ТЕХНИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Взвешивают около 1,5 г муки с погрешностью ±0,001 г и помещают в сухую коническую колбу вместимостью 250—300 см 3 , снабженную пробкой. Отмеривают цилиндром с ценой деления 0,1 см 3 под тягой 2 см 3 четыреххлористого углерода для извлечения жира из образца, добавляют пи­петкой 100 см 3 биуретового реактива. Закрытую пробкой колбу встряхивают на механическом встряхивателе в течение 60 мин. Далее вытяжку центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 4500 мин- 1 . Прозрачный центрифугат помещают в кю­веты фотоэлектроколориметра с толщиной слоя раствора 5 мм. Измерение оптической плотности производят при длине волны 550 нм.

По величине оптической плотности белковой вытяжки опреде­ляют содержание белка в навеске (мг) с помощью калибровоч­ной кривой (рис. 1). Рассчитывают массовую долю белка (в %) на сухие вещест­ва муки.

Источник

Лабораторная работа №2. Количественное определение белков

Лабораторная работа №2

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Для количественного определения белков применяют физические, химические и биологические методы.

Из физических методов простейшим кажется взвешивание чистого белка. Однако белки очень гигроскопичны, и полностью удалить из их состава воду столь трудно, что этот способ количественного определения белков применяют редко. Кроме того, выделить весь белок из препарата практически невозможно.

Наибольшее распространение из физических методов количественного определения белков получили три: рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок.

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простым химическим методом определения белка является количественное определение общего или белкового азота. Умножая величину процентного содержания общего азота на коэффициент 6,25 (среднее содержание азота в белках — 16%, отсюда 100∙16 = 6,25), получают данные о содержании сырого протеина. Проделывая ту же операцию с величиной, характеризующей содержание белкового азота, получают данные о количестве белка.

На том же принципе основаны два других метода химического определения белков: по содержанию металла и по содержанию той или иной аминокислоты. Например, в гемоглобине содержится 0,34% железа. Если в изучаемом на содержание гемоглобина препарате нет других железосодержащих соединений, то определение в препарате железа дает возможность рассчитать содержание гемоглобина. Аналогично рассуждают, если в составе препарата определено содержание какой-либо аминокислоты, доля которой в белке хорошо известна. Оба перечисленных метода применяются лишь в отдельных случаях.

Самым распространенным химическим методом количественного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специфическим реагентом. Чтобы рассчитать концентрацию белка, в этом случае строят калибровочный график.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности препарата, можно составить представление о содержании в нем белка, обладающего данной активностью.

Оборудование, реактивы. Фотоколориметра КФК-2, кюветы для фотометрирования, рН-метр, магнитная мешалка, альбумин (для построения калибровки), биуретовый реактив, яичный белок, молоко, 1% фенолфталеин, 0,1 моль/дм3, 2,5% раствор сульфата кобальта, формалин 40%, 0,05 моль/дм3 серная кислота, коническая колба вместимостью 100 и 200 см3; пипетка вместимостью 20 см3; бюретка вместимостью 25 см3; прибор для автоматического отмеривания формалина вместимостью 1 см3, цилиндр мерный вместимостью 100 см3; бюретка вместимостью 25 см3 с ценой деления 0,10 см3; мерная пипетка вместимостью 50 см3; стаканы на 50 мл, воронка; бумажный фильтр, фильтровальная бумага.

Работа 1. Количественное определение белка по биуретовой реакции

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди. Чувствительность метода составляет от 2 до 10 мг белка в пробе.

Оптическую плотность растворов определяют с помощью фотоколориметра КФК-2 (рис. 1)

Рис. 1. Общий вид колориметра КФК-2:

1 — микроамперметр типа М907; 2 — осветитель; 3 — ручка для введения светофильтров в световой поток; 4 — ручка для ввода кювет в световой поток; 5 — ручка «ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ» для включения фотоприемников; 6 — ручка «УСТАНОВКА 100 ГРУБО»; 7 — ручка «ТОЧНО»

Как известно, зависимость между интенсивностью проходящего светового потока I и содержанием в растворе окрашенного вещества описывается законом Бугера-Ламберта-Бера:

I = I0∙10-ξcl ,

где I — интенсивность светового потока после прохождения через раствор окрашенного вещества;

ξ — молярный коэффициент поглощения (экстинкции); константа для данного вещества;

с — молярная концентрация окрашенного вещества, моль/дм ;

l — толщина светопоглощающего слоя раствора, см.

Из вышеуказанного уравнения можно получить оптическую плотность раствора D:

Следовательно, оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации вещества в растворе. Прямая пропорциональная зависимость соблюдается только при низких концентрациях раствора и определенных значениях рН (рН = 2,3 ±0,1), которые создаются буферными растворами.

Принципиальная оптическая схема КФК-2, представленная на рис. 2, показывает ход светового потока в приборе. Нить лампы изображается конденсором в плоскости диафрагмы. Это изображение переносится объективом через систему светофильтров в кювету с исследуемым раствором. Для выделения узких участков спектра из сплошного спектра излучения лампы имеются цветные светофильтры, Теплозащитный светофильтр вводится в световой пучок при работе в видимой области спектра (400. 490 им). Для ослабления светового потока при работе в спектральном диапазоне (400. 540 нм) установлен нейтральный светофильтр.

Рис. 2. Принципиальная оптическая схема КФК-2:

1 — галогенная малогабаритная лампа; 2 — конденсор; 3 — диафрагма (d=2 мм); 4, 5 — объектив; 6 — теплозащитный светофильтр; 7 — нейтральный светофильтр; 8 — цветные светофильтры; 9, 11 — защитные стекла; 10 — кювета с исследуемым раствором; 12 — фотодиод ФД-24К для работы и области спектра 590 . 980 нм; 13 — светофильтр из цветного стекла СЗС-16; 14 — пластинка, разделяющая световой поток; 15 — фотоэлемент Ф-26 для работы в области спектра 315. 540 нм; 16 — линзы; 17 — кюветы малой емкости; 18 — линзы; 19 — приставка микроанализатора

Прошедший через кювету световой поток попадает на пластину, которая делит его на две части: около 10% потока направляется на фотодиод и около 90% — на фотоэлемент.

Для уравнивания фототоков, снимаемых с фотодиода при работе с различными цветными светофильтрами, перед ним установлен светофильтр.

Таким образом, световой поток, пройдя через исследуемый раствор, воздействует одновременно и на фотодиод, и на фотоэлемент. Вход усилителя постоянного тока подключен к одному из них. Ток подключенного светоприемника проходит через усилитель и попадает на измерительный прибор — микроамперметр. Он имеет шкалу, оцифрованную в коэффициентах пропускания (Т) от 100% до 0% и оптической плотности (D) от 0 до 3,0.

Фотоэлемент обеспечивает изменение чувствительности электрической схемы в соотношениях 1 : 1, 1 : 3 и 1 ; 9 (положения переключателя соответственно «3», «2» и «1», обозначенные черным цветом). Фотодиод — 1 : 9, 1 : 3 и 1 : 1 (положения переключателя соответственно «1»:, «2» и «3», обозначенные красным цветом). При работе фотоэлемента отключается фотодиод и наоборот.

Примечание. Жидкость в кювету необходимо наливать до метки на ее боковой стенке, не следует наклонять кювету при установке в кюветодержатель. Перед каждым измерением рабочие поверхности кювет необходимо протирать спирто-эфирной смесью. При установке кювет в кюветодержатели нельзя касаться пальцами рабочих участков поверхностей (ниже уровня жидкости в кювете), так как наличие загрязнений или капель раствора на рабочих поверхностях кюветы приводит к получению неверных результатов измерений.

Порядок работы на колориметре КФК-2. Колориметр включают в сеть за 15 мин до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто.

Устанавливают светофильтр с длиной волны (590 ± 10) нм. На лицевой панели колориметра он отмечен красным цветом.

Ручку «ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ» переводят в положение «1», также отмеченное красным цветом, ручки «УСТАНОВКА 100 ГРУБО» и «ТОЧНО» — в крайнее левое положение.

Проверяют установку стрелки на «0» по шкале коэффициентов пропускания «Т» при открытом кюветном отделении. При смещении стрелки ее подводят к нулю с помощью потенциометра «НУЛЬ».

В заднее гнездо кюветодержателя в световой поток помещают кювету с опытной пробой, в переднее — с контрольной. Крышку кюветного отделения закрывают. (В случае проверки оптической плотности рабочего раствора красителя в заднее гнездо кюветодержателя помещают кювету с дистиллированной водой.)

Ручками «ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ», «УСТАНОВКА 100 ГРУБО» и «ТОЧНО» устанавливают стрелку прибора на «0» по шкале оптической плотности «0». Ручка «ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ» может находиться в одном из трех положений: «1» «2» или «3», отмеченных красным цветом.

Поворотом ручки кюветодержателя кювету с опытной пробой заменяют на кювету с контрольной. Снимают показание разности оптической плотности по шкале «0».

Измерения проводят 3 раза. Среднее значение используют для расчета массовой доли белка в исследуемом образце.

Построение калибровочной кривой. Готовят ряд растворов исследуемого вещества с известными концентрациями. Измеряют оптические плотности каждого из этих растворов и строят график (калибровочную кривую), откладывая по горизонтальной оси (абсциссе) известные концентрации, а по вертикальной оси (ординате) — соответствующие им значения оптической плотности (экстинкцию) (рис. 3).

Рис. 3. Калибровочная кривая, построенная со стандартным растворам белка.

Пользуясь калибровочной кривой, определяют неизвестную концентрацию вещества в исследуемом растворе. Для этого исследуемый раствор наливают в ту же кювету, для которой построена кривая и, включив тот же светофильтр, определяют оптическую плотность раствора. Затем по калибровочной кривой находят концентрацию, соответствующую измеренному значению оптической плотности.

Ход работы. К 1 мл исследуемого раствора, содержащего от 2 до 10 мг белка, добавляют 4 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭКе при 540 нм.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.

Результаты представить в виде калибровочной прямой с экстраполяцией данных по исследуемому раствору. Сделать выводы.

Определение массовой доли белка в молоке методом формального титрования

Данный титриметрический метод основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбо-новых кислот белков раствором гидроксида натрия. Объем гидроксида натрия, затраченный на нейтрализацию, пропорционален массовой доле белка в молоке.

Известно, что в состав белков молока входят моноаминомонокарбоновые (нейтральные), моноаминодикарбоновые (кислые) и диаминомонокарбоновые (основные) кислоты. На долю кислых аминокислот — аспарагиновой и глутаминовой — приходится до 30%, а на долю основных — лизина, аргинина — до 9% от общего количества аминокислот. Поэтому в целом белки молока кислые.

Карбоксильные и аминные группы аминокислот способны к ионизации, в связи с чем белки молока несут отрицательные и положительные заряды.

В методе формольного титрования массовую долю белка в молоке определяют по количеству ионизированных аминных групп, находящихся на поверхности мицелл казеина и молекул сывороточных белков,

Ионизированные аминные группы способны разрушаться формальдегидом с выделением ионов водорода в раствор. Количество последних определяют, оттитровывая их щелочью.

Поскольку исходное молоко имеет слабокислую реакцию среды (рН = 6,7. 6,8), то, во избежание ошибок при определении массовой доли белка, молоко вначале нейтрализуют.

Основные реакции, характеризующие сущность метода, представлены следующими уравнениями:

Нейтрализация молока:

Взаимодействие ионизированных аминных групп с формальдегидом с образованием дигидроксиметилпроизводных белка:

Повторная нейтрализация раствора:

Таким образом, титриметрический метод определения массовой доли белка основан на измерении объема титранта (раствора щелочи), вступающего в реакцию с определяемым ионом (Н+). Момент окончания реакции (точку эквивалентности) устанавливают с помощью потенциометрического анализатора или в упрощенной методике — по изменению окраски индикатора (индикаторный способ).

Работа 2. Определение массовой доли белка индикаторным способом

В качестве индикатора используют фенолфталеин, приобретающий окраску в нейтральной и щелочной среде.

Ход работы. В колбу вместимостью 100 см3 отмеривают 20 см3 молока, 0,25 см3 (10. 12 капель) 1%-го раствора фенолфталеина и титруют раствором гидроксида натрия с концентрацией 0,1 моль/дм3 до появления розовой окраски, соответствующей цвету эталона (смешивают 20 см3 молока и 0,5 см3 2,5%-ного раствора сульфата кобальта). Затем вносят прибором для автоматического отмеривания 4 см3 (4 объема) нейтрализованного 40%-ного формалина и вновь титруют раствором гидроксида натрия с концентрацией 0,1 моль/дм3 до появления окраски эталона. Количество щелочи, пошедшее на второе титрование (при первом титровании она расходуется на нейтрализацию веществ, обусловливающих кислотность молока), умножают на коэффициент 0,959 и получают массовую долю белков в молоке в процентах.

Для перевода количества раствора гидроксида натрия с концентрацией 0,1 моль/дм3 в проценты белка можно пользоваться табл. 1.

Таблица 1. — Зависимость массовой доли белков от объема раствора щелочи (Сэ = 0,1 моль/дм3), затраченного на титрование проб молока в присутствии формалина

Источник

Adblock
detector